Selezione e caratterizzazione di microrganismi destinati alla produzione di distillati

"Auswahl und Kennzeichnung der für die Herstellung von Destillaten bestimmten Mikroorganismen"

Der Grappa ist ein alkoholisches Getränk, das durch die Destillation von Trester gewonnen wird, der seinerseits wieder von ausschließlich in Italien produzierten Trauben stammt. Der Herstellungsvorgang beginnt im Keller, wo die Vinifikation stattfindet: nach der Weinlese und dem Keltern der Trauben, ist der Most getrennt vom Trester, der hauptsächlich aus den Schalen und den Kernen besteht, mit und ohne Traubenkamm. Der von der weißen Vinifikation gewonnene Trester enthält noch nicht vergorenen Zucker. Aus diesem Grund wird das an die Destillerien gelieferte pflanzliche Material für eine unbestimmte Zeit aufbewahrt, um die Entfaltung der alkoholischen Gärung zuzulassen. Die Trester können von wenigen Tagen bis einigen Wochen in verschiedenen Orten aufbewahrt werden, in Silos oder in Plastiktunnel. Der wichtigste chemische Vorgang, der durch die Hefewirkung in Gang gesetzt wird, ist der Abbau von Zucker bei gleichzeitiger Produktion von Alkohol, auch wenn ebenso andere Moleküle mit positiven (aromatischen Substanzen) und negativen Effekten (toxische Zusammensetzungen) von der einheimischen Mikroflora hervorgerufen werden. Mit dem Ziel, das durch ungünstige Lagerung verursachte Verderben des Pflanzenmaterials zu vermeiden, haben moderne Destillerien den Gebrauch von technologischen Behandlungen eingeführt (Verbesserung des pH Werts, Kontrolle der Temperatur, Abwesenheit von Sauerstoff) und seit Kurzem auch die Verwendung von ausgewählter Hefe zwecks Kontrolle der mikrobiellen Population. Diesbezüglich fehlen beinahe internationale Studien auf dem Gebiet des Grappas. Diese von der Region Venetien finanzierte Studie fügt sich in ein breites Projekt ein, das sich mit der Hefenauswahl als Starter und mit der Impfung des Tresters, der für die Grappaproduktion bestimmt ist, beschäftigt. Das erste zu verfolgende Ziel war die Erforschung der Zusammensetzung und der Dynamik der Population der Mikroflora der Hefen, mittels konventioneller und Molekular- Methoden, welche in der Literatur bzw. in Studien von Gruppen von Mikrobiologen des "Dipartimento di Biotecnologie Agrarie" zu finden sind. Es wurden zwei Grappasorten ausgewählt, Moscato und Prosecco, die von zwei verschiedenen Zonen der Region Venetien stammen. Das Abzählen der Hefenpopulation ist zu Beginn, nach 4 und 15 Tagen der Lagerung unter anaeroben Bedingungen durchgeführt worden. Etwa siebzig isolierte Proben pro Musterentnahme sind auf dem Niveau der Spezie mittels RAPD-PCR Analyse und einer weiteren Sequenzanalyse der DNA von der Region ITS identifiziert worden. Am Anfang der Lagerung konnte eine gute Biodiversität in beiden Trester beobachtet werden, mit einem hohen Prozentsatz von Hanseniaspora opuntiae, aber die Abwesenheit der Stämme der Saccharomyces (Zuckerhefen), die hingegen nach nur 4 Tagen der Gärung dominant geworden sind, zeugen von dem gleichen Niveau bis zum Ende der Gärung. In der Folge wurden die Behandlungseffekte der Kühlung und Säurebildung auf die Dynamiken der Hefepopulationen während der Lagerung untersucht. Es wurden insgesamt 200 isolierte Proben vom Trester des Prosecco, gesäuert und nicht gesäuert, nach 4 und 15 Tagen der Lagerung gesammelt. Die Identifikation im strengen Sinne der zu der Gruppe der Saccharomyces (Zuckerhefen) angehörigen weinkundlichen Stämme, ist mittels Multiplex PCR durchgeführt worden und seine Kennzeichnung auf der Höhe der Stämme ist durch die mitochondriale DNA Analyse gewonnen worden. Die genetischen Analysen haben die Entwicklung der diversen Stämme in gesäuerter Umgebung und unter nicht gesäuerten Kontrollbedingungen unterstrichen. Es hat sich gezeigt, dass die für die Hemmung der bakteriellen Mikroflora angewandte Behandlung der Säurebildung, in der Lage ist, die Hefenpopulation zu beeinflussen, eher unter einem qualitativen als unter einem quantitativen Gesichtspunkt. Die Verringerung des pH Werts hat einen hohen Selektionseffekt, in der Tat nur 18 von 121 identifizierten Stämmen sind unter beiden Bedingungen gefunden worden. Eine Gesamtsumme von 104 gekennzeichneten isolierten Proben, die der Gruppe der Saccharomyces cerevisiae (Obergärige Hefe) zugehörig sind, wurden aus einem Pool von circa 1000 Hefen ausgesucht, die im Laufe mehrerer Experimente gesammelt wurden, unter technologischen Behandlungen während der Phase der Silierung. Die isolierten Proben sind in künstlichem Most gewachsen, um ihre Gärungsleistung zu überprüfen. Die isolierten Hefen des Trester von Moscato zeigen die besten Merkmale im Sinne der Gärungsfähigkeit, ausgedrückt als Zuckerkonsum nach 2 und 7 Tagen der Gärung. Es wurde die Höhe der Schaumproduktion untersucht und am Ende der Gärung ist ebenso eine sensorische Bewertung durchgeführt worden, um die möglichen unangenehmen Düfte zu erkennen. Es sind auch andere technologische Merkmale überprüft worden, jene der Resistenz gegen Antioxidations und Antiseptikum Schwefeldioxid und die Produktion von Schwefelwasserstoff. Man bedenke, dass die Resistenz gegen alle SO2 Isolierten in der Lage ist, eine Konzentration von 50 mh/l, die gewöhnlich im Weinkeller verwendet wird, zu tolerieren. Bei der Zwischenmenge von 100 mg/l stammen die wiederstandsfähigsten Stämme aus dem Trester des nicht gesäuerten Prosecco. Darüberhinaus ist bekannt, dass die mikrobielle Glykosedasen Aktivität über die Hydrolyse der vorausgehenden nicht flüchtigen und geruchslosen Glycoseverbindungen dem Aroma des Weins und der Destillate verleiht, die Terpenole und andere aromatische Zusammensetzungen freigeben. Die Glykoside, Zusammensetzungen von terpenischem Kohlenwasserstoff (Aglycon) und von Kohlenhydrat, sind in den Schalen konzentriert, daher ist der Beitrag der glykosidasischen Aktivität für den Ausdruck der Aromen des Grappas bestimmt. Die Aktivität der b-Glykosidasen, ist schnell in allen isolierten Proben getestet worden, sei es mit der Anwendung der Fluorometer-methode eigens auf den Punkt gebracht, sei es, dass die Zellen im kleinsten Terrain wachsen, mit der Disaccharide Zellobiose als einzige Quelle für Kohlenstoff. Die technologischen Merkmale und die kontrollierte Qualität für alle Isolierten sind statistischen Analysen unterzogen worden, mit dem Ziel die Hefen mit den besten komplexen Merkmalen zu bestimmen, um als Starter in der Erzeugung von Destillaten verwendet zu werden. Kürzlich ist es vorhergesagt worden, dass die Aktivität der b-Glykosidasen mit der höchsten eso- _-1,3- glucanasi EXG1 der Obergärigen Hefe (Saccharomyces cerevisiae) korreliert ist, eingebunden in Prozesse wie Wachstum, Knospung und Begattung. Aus diesen Gründen ist ein auf der Konstruktion von Mutanten basierten Ansatz für die kodifizierten Gene für esoglucanase in Betracht gezogen worden. Im Besonderen sind zwei Mutanten der Deletion für die Gene EXG1 und EXG2 konstruiert worden bzw. einem Protokoll folgend, das im Wesentlichen auf dem Prinzip der homologen Wiederverbindung basiert. Der Effekt der Aktivität der b-Glykosidasen ist mit der fluorimetrischen Probe getestet worden, wobei eine leichte Verringerung des ungültigen Mutanten exg1 unterstrichen wird. Darüber hinaus sind die mutierten Stämme im natürlichen Most des Proseccos gewachsen, in Gärungsapparaten von 1L, aber die Gärungskurven haben nicht die signifikanten Unterschiede zwischen den Stämmen gezeigt. Daher kann man folgern, dass die Deletion der Gene für die Esoglucanase das Hefewachstum wahrscheinlich nicht beeinflussen. Die gewonnenen Ergebnisse zeigen auf, dass Trester verschiedener Herkunft oder Trester, die verschiedenen technologischen Behandlungen unterzogen werden, eine weit reichende Quelle für Hefen darstellen, welche in der Grappaproduktion als Starter fungieren können.