Selezione e caratterizzazione di microrganismi destinati alla produzione di distillati

La Grappa è una bevanda alcolica ottenuta dalla distillazione di vinacce derivate da uve prodotte esclusivamente in Italia. Il processo produttivo comincia in cantina dove ha luogo la vinificazione: dopo la raccolta e la pigiatura dell’uva, il mosto è separato dalle vinacce, costituite principalmente dalle bucce e dai vinaccioli, con o senza raspi. Le vinacce ottenute dalla vinificazione in bianco contengono zuccheri non ancora fermentati. Per questo motivo il materiale vegetale conferito alla distilleria è conservato per un periodo variabile per consentire lo svolgimento della fermentazione alcolica. Le vinacce possono essere conservate da pochi giorni ad alcune settimane in diversi modi, in silos o in tunnel di plastica. Durante questo periodo, il principale processo chimico che avviene ad opera dei lieviti è la degradazione degli zuccheri con produzione di alcol, anche se un numero elevato di altre molecole con effetti positivi (sostanze aromatiche) e negativi (composti tossici), può originare dalla microflora indigena. Con lo scopo di evitare il deterioramento del materiale vegetale dovuto a inopportune condizioni di stoccaggio, le moderne distillerie hanno introdotto l’uso di alcuni trattamenti tecnologici (miglioramento del pH, controllo della temperatura, assenza di ossigeno), e recentemente ha trovato interesse anche l’impiego di lieviti selezionati per il controllo della popolazione microbica. A questo proposito, studi internazionali nel campo della grappa sono pressocchè assenti, essendo la sua produzione limitata per legge al nostro territorio nazionale. Questo studio si inserisce nell’ambito di un più ampio progetto, finanziato dalla Regione Veneto, di selezione di lieviti da usare come starter da inoculare nella vinaccia destinata alla produzione di grappa. Il primo obiettivo da perseguire era lo studio della composizione e delle dinamiche di popolazione della microflora di lieviti, mediante metodi convenzionali e molecolari presenti in letteratura o studiati dal gruppo di Microbiologia del Dipartimento di Biotecnologie Agrarie. Sono state scelte due varietà di grappa, Moscato e Prosecco, provenienti da due distinte aree della Regione Veneto. Le conte della popolazione di lieviti sono state effettuate all’inizio, dopo 4 e 15 giorni di stoccaggio in condizioni di anaerobiosi. Una settantina di isolati per ogni campionamento sono stati identificati a livello di specie mediante analisi RAPD-PCR e successivo sequenziamento della regione ITS. All’inizio dello stoccaggio si è osservata una buona biodiversità in entrambe le vinacce, con un’alta percentuale di Hanseniaspora opuntiae, ma assenza di ceppi di Saccharomyces, che invece diventano dominanti dopo soli 4 giorni di fermentazione, attestandosi allo stesso livello fino alla fine della fermentazione. Successivamente sono stati studiati gli effetti dei trattamenti di refrigerazione e acidificazione sulle dinamiche delle popolazioni di lieviti durante lo stoccaggio. Sono stati collezionati un totale di 200 isolati da vinacce di Prosecco acidificate e non acidificate, dopo 4 e 15 giorni di stoccaggio. L’identificazione di ceppi enologici appartenenti al gruppo Saccharomyces sensu stricto è stata effettuata mediante multiplex PCR, e la loro caratterizzazione a livello di ceppo è stata ottenuta con l’analisi del DNA mitocondriale. Le analisi genetiche hanno evidenziato lo sviluppo di ceppi diversi nell’ambiente acidificato e nel controllo non acidificato. Il trattamento di acidificazione, applicato per inibire la microflora batterica, si è rivelato in grado di influenzare la popolazione di lieviti dal punto di vista qualitativo piuttosto che quantitativo. La diminuzione del pH ha provocato un grosso effetto di selezione, infatti solo 18 dei 121 ceppi identificati sono stati trovati in entrambe le condizioni. Un totale di 104 isolati identificati come appartenenti al gruppo Saccharomyces cerevisiae sono stati scelti da un pool di circa 1000 lieviti, collezionati nel corso delle diverse sperimentazioni, da vinacce di diversa origine o sottoposta a trattamenti tecnologici durante il periodo di insilamento. Gli isolati sono stati cresciuti in mosto sintetico per verificare le loro performance di fermentazione. I lieviti isolati da vinacce di Moscato mostrano le caratteristiche migliori in termini di vigore fermentativo, espresso come consumo di zucchero dopo 2 e 7 giorni di fermentazione. E’ stato indagato anche il livello della produzione di schiuma, e alla fine della fermentazione è stata condotta una valutazione sensoriale per individuare i possibili odori sgradevoli. Sono stati esaminati anche altre caratteristiche tecnologiche, quali la resistenza all’antiossidante e antisettico anidride solforosa e la produzione di idrogeno solforato. Considerando la resistenza alla SO2 tutti gli isolati sono in grado di tollerare una concentrazione di 50 mg/l, comunemente usata in cantina. Alla dose intermedia di 100 mg/l i ceppi più resistenti provengono da vinacce di Prosecco non acidificate. Inoltre, è noto che l’attività glicosidasica microbica contribuisce all’aroma di vini e distillati attraverso l’idrolisi di precursori glicoconiugati non volatili e inodori, che rilasciano terpenoli e altri composti aromatici. I glicosidi, composti di un’idrocarburo terpenico (aglicone) e di un carboidrato, sono concentrati nella buccia, perciò il contributo dell’attività glicosidasica è determinante per l’espressione dell’aroma della grappa. L’attività _-glucosidasica pertanto, è stata rapida mente testata in tutti gli isolati sia utilizzando un metodo fluorimetrico appositamente messo a punto, sia crescendo le cellule in un terreno minimo contenente il disaccaride cellobiosio come sola fonte di carbonio. I caratteri tecnologici e di qualità monitorati per tutti gli isolati sono stati sottoposti ad analisi statistica con lo scopo di individuare i lieviti con le caratteristiche complessive migliori per essere utilizzati come starter nella produzione di distillati. Recentemente è stato suggerito che l’attività _-glucosidasica sia correlata alla maggiore eso- _-1,3- glucanasi EXG1 di Saccharomyces cerevisiae, coinvolta in processi come crescita, gemmazione e mating. Per questi motivi è stato preso in considerazione un approccio basato sulla costruzione di mutanti per i geni codificanti per esoglucanasi. In particolare sono stati costruiti due mutanti di delezione per i geni EXG1 ed EXG2 rispettivamente, seguendo un protocollo basato essenzialmente sul principio della ricombinazione omologa. L’effetto della delezione sull’attività _-glucosidasica è stato provato con il saggio fluorimetrico, evidenziando una lieve diminuzione nel mutante nullo exg1. Inoltre i ceppi mutati sono stati cresciuti in mosto naturale di Prosecco, in fermentatori da 1L, ma le curve di fermentazione non hanno rivelato differenze significative tra i ceppi. E’ possibile concludere perciò che probabilmente la delezione dei geni per le esoglucanasi non influenza la crescita dei lieviti. I risultati ottenuti complessivamente indicano che le vinacce di diversa origine o sottoposte a trattamenti tecnologici rappresentano una fonte ampia di lieviti che possono essere selezionati come starter nel campo della produzione della grappa.